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实验要点及说明：

1．本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法；

2．所使用的盖玻片应该为优质玻璃，并经过铬酸洗液处理；

3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻；

4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率；

5．如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。

产物属性：  

商品介绍：

冷冻保存细胞之方法？

冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ （-20 ℃30 分钟*） → -80 ℃16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 长期储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 ℃不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织*被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1丑后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的笔叠厂冲洗细胞2次，每次10尘颈苍，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15尘颈苍；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用笔叠厂冲洗3次，每次10尘颈苍，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

小鼠 EGFR / HER1 / ErbB1 细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

小鼠 EGFR / HER1 / ErbB1 细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

小鼠 TETHERIN / BST2 / CD317 细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

小鼠 PGRL / IGSF8 细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

小鼠 Prostatic Acid Phosphatase / ACPP 细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

小鼠 MFI2 / CD228 / melanotransferrin 细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

小鼠 NBL1 / DAND1 / DAN 细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

小鼠 TIGIT / VSTM3 细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

小鼠 NAALADL1 细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

小鼠 TROP2 / TACSTD2 细胞裂解液 (阳性对照) (变性)

小鼠肠动脉平滑肌细胞生长释放肽 95%β-硫丹标准溶液 100μg/ml,u=3%Anti-VSIG4 /FITC  荧光素标记T负调节蛋白之一抗体IgG

Boc-L-谷-1-叔丁酯 98%β-硫丹标准溶液 10μg/ml,u=5%Anti-VSV-G tag/FITC  荧光素标记VSV-G tag标签抗体IgG

N-芴甲氧羰基-L-谷 1-烯基酯  99%硫丹 分析标准品，98%（剧品）Anti-VSV-G tag/HRP  辣根过氧化物标记VSV-G tag标签抗体IgG

N-芴甲氧羰基-L-谷 5-烯基酯  96%标准溶液 100μg/ml,u=2%（剧品）Anti-VTG/FITC  荧光素标记卵黄蛋白原抗体IgG

N-芴甲氧羰基甘五氟苯酯   97%标准溶液 10μg/ml,u=3%（剧品）Anti-VTN/FITC  荧光素标记玻璃粘连蛋白抗体IgG

H-Gln-2-Chlorotrityl Resin 0.3~0.8 mmol/g, 100~200 mesh酮中乙嘧硫磷标准溶液 100μg/ml,u=2%Anti-VWCE/URG11/FITC  荧光素标记乙型肝炎病X蛋白(HBxAg)抗体IgG

H-Gln(Trt)-2-Chlorotrityl Resin 0.3~0.8 mmol/g, 100~200 mesh酮中乙嘧硫磷标准溶液 10μg/ml,u=2%Anti-VWF/FITC  荧光素标记血管假性血友病因子/血管性血友病因子抗体IgG

H-Glu-2-Chlorotrityl Resin 0.3~0.8 mmol/g, 100~200 mesh烯炔菊酯 分析标准品，97%Anti-VWF/RBITC  红色罗丹明标记血管假性血友病因子/血管性血友病因子抗体IgG